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Piani di Settore
 

Bando prt. D.M. 186 del 1 agosto 2007
G.U. n. 208 del 07/09/2007

 

Symplitaly

Costituzione, selezione e propagazione di Ibridi Interspecifici di Lilium
Approvato con DM 11078/7643/09 del 07/05/2009
Importo totale € 421.700,00 - Contributo concesso € 210.850,00 pari al 50% della spesa ammessa


SOGGETTO PROPONENTE

FLORINVEST spa

 

COORDINATORE

CRA VIV - Unità di Ricerca per il Vivaismo e la Gestione del Verde Ambientale ed Ornamentale

 

PARTNER COINVOLTI

Florinvest S.p.a.
CRA-VIV, Unità di Ricerca per il Vivaismo e la Gestione del Verde Ambientale ed Ornamentale
DAFNE Dipartimento di Scienze e Tecnologie per l'Agricoltura, le Foreste, la Natura e l'Energia, Università degli Studi della Tuscia

 

PRESENTAZIONE DEL PROGETTO

Le bulbose sono ampiamente utilizzate sia per la produzione di fiore reciso (la più importante da un punto di vista economico è il Lilium), che per la coltivazione in vaso o in giardino. All'inizio del 2000, tre erano le tipologie commerciali di Lilium prodotte in Italia: ibridi Asiatici, ibridi Orientali ed ibridi di L. longiflorum (rapporto 60-30-10%). Oggi, vengono prevalentemente coltivati  ibridi LA ed ibridi Orientali, con una presenza ridotta di L. longiflorum. Stentano ad affermarsi ibridi interspecifici LO ed OT, che si stanno invece diffondendo soprattutto in Giappone e Corea.
Il Lilium comprende specie generalmente allogame, quasi tutte caratterizzate da una marcata auto-incompatibilità: ne consegue una naturale incapacità a produrre semi se auto-impollinate. Al fine di ampliare la variabilità genetica la realizzazione di ibridi interspecifici di Lilium è stato ed è tutt'ora l'obiettivo primario di molti programmi di miglioramento genetico, anche se può essere limitata dal verificarsi di fenomeni di incompatibilità. La principale difficoltà riscontrata nel realizzare l'ibridazione interspecifica è la presenza di barriere sessuali pre- e post-zigotiche. Alcuni risultati positivi sono stati ottenuti attraverso la tecnica dell'embriocoltura, della coltura di ovuli (che ha permesso di superare le barriere di incompatibilità post-zigotica) e con la tecnica della poliploidizzazione.
Per verificare la natura del materiale ottenuto da incroci e per studi sul genere, si ricorre all'impiego di marcatori molecolari. Le sequenze ITS sono state analizzate in Lilium carniolicum per studi di filogenesi e sistematica e per la valutazione di ibridi interspecifici. Anche marcatori RAPD sono stati utilizzati per valutare l'effettiva natura di ibridi interspecifici. Attualmente i microsatelliti (SSR) sono considerati tra i marcatori più interessanti e versatili e in Lilium philadelphicum e Lilium japonicum sono stati isolati dei microsatelliti specifi.
Una tecnologia interessante applicata invece alla propagazione in vitro, al fine di aumentare la competitività commerciale, riguarda l'utilizzo di bioreattori low-cost, in cui è previsto l'impiego del mezzo liquido come fonte di nutrienti. L'utilizzo di sistemi di propagazione double-phase o del mezzo liquido sono stati applicati in Lilium: nel primo caso a germogli messi su mezzo agarizzato (supporto e fonte di nutrimento) è stato aggiunto un volume di liquido (fonte di nutrimento) ottenendo una maggiore formazione e crescita di bulbetti; risultati analoghi sono stati ottenuti nel secondo caso.

 

OBIETTIVI

Il progetto si pone come obiettivo principale l'ottenimento di una linea nazionale di ibridi interspecifici di Lilium attraverso l'applicazione di tecniche di breeding tradizionali ed avanzate e la successiva messa a punto di sistemi di certificazione di qualità applicati a metodologie propagative. La ricerca si articola nei seguenti punti:
a) individuazione e reperimento di specie/varietà dei diversi gruppi commerciali, da avviare ad un programma di incroci;
b) impiego di protocolli per la produzione di ibridi interspecifici, così da superare le barriere pre- e post-zigotiche che ne ostacolano l'ottenimento (embryo-rescue, coltura di embrioni, coltura di ovuli);
c) propagazione rapida in vitro (coltura su mezzo liquido) mediante l'impiego di tecniche che consentano di ottenere grandi quantità di materiale virus-esente da avviare all'ingrossamento (immersione temporanea o immersione continua);
d) ottenimento, previa selezione, di progenie in possesso di caratteri commerciali validi, da avviare alla propagazione ed alla successiva valutazione agronomica e commerciale;
e) creazione di una collezione di germoplasma selezionato e idoneo a successivi ampliamenti del programma di miglioramento genetico.

 

STATO DI AVANZAMENTO

Creazione di una collezione di germoplasma di Lilium: il materiale di partenza è costituito da 3 varietà del gruppo degli ibridi orientali (cv All is All, Nova Zembla e Mother's Choice) e da 2 varietà di L. longiflorum (cv White Heaven e White Triumph). Fanno parte anche ibridi interspecifici LA (cv  Courier e Brindisi), alcuni cloni di ibridi Asiatici selezionati presso il CRA-VIV, ed alcune specie selvatiche (Lilium regale, Lilium 'Pink Perfection' e Lilium 'Kiwi Fanfare').
Realizzazione del programma di incroci: presso il CRA-VIV, sono stati messi in coltura in serra i bulbi: sono stati effettuati tre impianti scalari a cadenza mensile (primavera 2010, 2011 e 2012) con l'obiettivo di avere diverse fioriture nel periodo primaverile-estivo. 1-2 gg prima dell'antesi, si è proceduto alla emasculazione del gametofito maschile e l'impollinazione è stata eseguita seguendo il cut-style method. Per ciascuna combinazione di incrocio, sono stati eseguiti gli incroci diretti ed i corrispondenti incroci reciproci, realizzando in totale circa 1000 incroci, nel corso della primavera 2010 e circa 800, nella primavera 2011 e 2012. Gli ovari sono stati raccolti dopo 14 gg dall'impollinazione.
Impiego di protocolli per la produzione di ibridi interspecifici di Lilium: gli ovari prelevati dalla piante madre sono stati sterilizzati, sezionati e messi in coltura su 2 substrati (denominati IAA0,5 e NAA1) (tab. 1), così da allestire una coltura in vitro di ovari. Sono stati mantenuti in cella climatica a 22-23°C, al buio per 50-60 gg. Dei circa 1000 ovari messi in vitro, sono stati trasferiti circa 8000 ovuli: gli ovuli particolarmente rigonfi e di colore bianco sono stati estratti dall'ovario e trasferiti singolarmente su piastre Petri (coltura di ovuli) contenenti 2 terreni di coltura (denominati IBA0,5 e NAA0,1), dove sono stati mantenuti per 90-120 gg. Trascorso tale periodo, gli ovuli da cui si è sviluppato l'embrione con relativa radichetta embrionale, sono stati trasferiti su nuovi terreni di coltura, denominati IBA0,5 (con funzione di moltiplicare i piccoli germogli) e MS0 (con funzione di ingrossare i nuovi bulbetti ottenuti). In tabella 3 sono elencati alcuni degli ipotetici ibridi ottenuti.
Valutazione genotipica dei nuovi individui: dalle foglie dei parentali e degli ipotetici ibridi conservati in vitro, è stato estratto il DNA. Inizialmente l'analisi è stata condotta per mezzo di marcatori RAPD, utilizzando alcuni primer della serie OPA ed OPB: i primer OPA11, OPA16, OPB04 ed OPB05 sono risultati i migliori, in quanto hanno permesso di evidenziare maggiori polimorfismi nel profilo di amplificazione dei parentali, con bande tipiche del genitore maschile e femminile (fig. 2). Per l'analisi SSR, sono stati utilizzati primer riportati in letteratura vedi tabella 2: soltanto alcuni (LpCA5, LpGA210 e LpGA4) hanno evidenziato polimorfismi. In particolare in figura 3 sono riportati i profili di amplificazione ottenuti con due diverse coppie di primer; in entrambi i casi è stato possibile individuare bande tipiche del parentale maschile e di quello femminile presenti negli ibridi.
Propagazione mediante bioreattori: la prova è stata realizzata presso l'Università della Tuscia, Dipartimento DAFNE (VT). L'esperimento è stato condotto ponendo all'interno di bioreattori (Balloon Type Bubble Bioreactor) clusters di germogli dell'ibrido commerciale (LA) Brindisi. Per ogni bioreattore è stato utilizzato 1 litro di substrato contenente 4,4 g di MS, 4,4 µM di BA, 1,1 µM di NAA e 6% di saccarosio (pH 5,8), in condizioni ambientali di 24ħ1°C e buio continuo. Il primo esperimento è stato finalizzato ad individuare una tecnica in grado di evitare possibili contaminazioni a carico del substrato durante la coltura in bioreattori. Per questo il materiale vegetale è stato ulteriormente sottoposto a sterilizzazione e i bioreattori sono stati impostati secondo il sistema ad immersione temporanea (TIS) con 30' di immersione ogni 15' per un totale di 8 cicli/gg. Nel corso del secondo esperimento il sistema ad immersione continua (con 0,1= volume d'aria/ volume totale, minuto) è stato messo a confronto con il sistema TIS; contemporaneamente è stata avviata una prova su substrato solido contenenti lo stesso substrato con l'aggiunta di agar allo 0,7%. Il materiale vegetale è stato preventivamente sterilizzato. L'impiego di bioreattori ha permesso un incremento della maggior parte dei parametri biometrici osservati rispetto alla propagazione su substrato solido. In particolare l'immersione continua ha fornito risultati migliori rispetto al sistema TIS, il quale a sua volta è risultato più idoneo rispetto al substrato solido. I germogli ottenuti sono stati ambientati con una percentuale di sopravvivenza del 100% per entrambi i trattamenti in bioreattore mentre nel caso del substrato solido tale percentuale si è ridotta al 75%.

 

AZIONI DI DIVULGAZIONE

Convegni e seminari organizzati presso il CRA-VIV
- 30/08-03/09/2010: Symplitaly 2010 - Second International Symposium on Genus Lilium - CRA-VIV, Unità di Ricerca per il Vivaismo e la Gestione del Verde Ambientale ed Ornamentale - Pescia (PT)
- 30/08/2010: Lilium: tecniche colturali, propagazione, diagnostica delle malattie, miglioramento della qualità. CRA-VIV, Unità di Ricerca per il Vivaismo e la Gestione del Verde Ambientale ed Ornamentale - Pescia (PT)
- 13/03/2012: Miglioramento genetico e valorizzazione di nuovi genotipi nel florovivaismo italiano - I contributi dal Bando Mipaaf "Imprese Florovivaistiche" (D.M. 186/2007) - CRA-VIV Pescia (PT)

Partecipazione a convegni con presentazioni orali o poster
- Diagnosi di virosi in Lilium e tecniche di risanamento Beatrice Nesi, Sara Lazzereschi, Domenico Rizzo Comunicazione orale: Lilium: tecniche colturali, propagazione, diagnostica delle malattie, miglioramento della qualità (Pescia, 30 agosto 2010)
- Virus detection and propagation of virus-free bulbs from selected progenies of pollenless lily Nesi B., Lazzereschi S., Pecchioli S.,Ruffoni B., and Grassotti A. Comunicazione orale: Symplitaly 2010 - Second International Symposium on Genus Lilium
- Costituzione, selezione e propagazione di ibridi interspecifici di lilium   (Symplitaly)- Poster presentato a Flormart 2011 nello spazio espositivo del MiPAAF.
- Il miglioramento genetico del Lilium Sara Lazzereschi, Beatrice Nesi Comunicazione orale: Lilium: tecniche colturali, propagazione, diagnostica delle malattie, miglioramento della qualità (Pescia, 30 agosto 2010)
- Costituzione, selezione e propagazione di ibridi interspecifici di Lilium Lazzereschi S., Nesi B., Pecchioli S., Grassotti A. Poster presentato al 2° Convegno Nazionale sulla Micropropagazione 7-9 Novembre 2011 Sanremo

Pubblicazioni
Cardona Suárez C.M., Colla G., Cardarelli M., Nesi B. (2011). Response to in vitro propagation of different Asiatic hybrids lilies. Acta Horticulturae, 900: 393-400.
Cardona Suárez C.M., Colla G., Cardarelli M. (2011). Micropropagazione del lilium in bioreattore: vantaggi e criticità del sistema. Italus Hortus, in press.
Grassotti A., Nesi B., Lazzereschi S., Cacini S., Pacifici S. (2011). Breeding Asiatic Hybrid Lilies: an Italian Experience. Acta Hort. 900, ISHS 2011: 237-242.
Nesi B., Haegi A., Mori J., Lazzereschi S., Pecchioli S., Grassotti A.(2011). Interspecific Hibrids in Lily: verification using molecular markers. Acta Hort. 900, ISHS 2011: 243-250.
Nesi B., Lazzereschi S., Pecchioli S., Grassotti A., Ruffoni B. (2011). Virus Detection and propagation of virus-free bulbs from selected progenies of pollenless lilies. Acta Hort. 900, ISHS 2011: 325-332.
Nesi B., Lazzereschi S., Pecchioli S., Grassotti A., Rizzo D., Stefani L., Paoli M. (2011). Biotechnological approaches for identification of  the main viruses in Lilium. Acta Hort. 900, ISHS 2011: 339-345.953: 91-96.
Antonetti M., Teani A., Burchi G., 2012. Sviluppo commerciale di nuove costituzioni di Limonium e di "statice. COLTURE PROTETTE 7/8: 48-62.
Nesi B., Lazzereschi S., Pecchioli S., Cardona Suarez C.M., Colla G., Cardarelli M., Grassotti A. (2012). Costituzione, selezione e propagazione di Ibridi Interspecifici di Lilium. Acta Italus Hortus 4: 85-94.
Nesi B., Lazzereschi S., Pecchioli S., Grassotti A., Rizzo D., Stefani L., Paoli M., Della Bartola M., Materazzi A. (2012). Detection of viruses infecting Lilium spp. by RT-PCR and Real-Time PCR. Book of Abstract XI International Symposium on Flower Bulbs and Herbaceous Perennials, Antalya 28 Marzo- 1 Aprile 2012: 59.
Rizzo D., Stefani L., Paoli M., Lazzereschi S., Nesi B., Pecchioli S., Della Bartola M., Materazzi A., Grassotti A. (2012). Occurrence of Lily Mottle Virus on Lilium in Italy. Plant Disease Note, Accepted for pubblication http://dx.doi.orgI10.1094/PDIS-12-11- 1019-PDN.

CONTATTI

Florinvest s.p.a., Scandicci (FI)
Dr.ssa Beatrice Nesi - CRA-VIV, Unità di Ricerca per  il Vivaismo e la Gestione del Verde Ambientale ed Ornamentale, Pescia (PT)  
DAFNE - Dipartimento di Scienze e Tecnologie per l'Agricoltura, le Foreste, la Natura e l'Energia, Università degli Studi della Tuscia, Viterbo