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Piani di Settore
 

Bando prt. n. D.M. 186 del 1° agosto 2007
G.U. n. 208 del 07/09/2007

 

ANEMOS 

Nuove tecnologie per la valorizzazione dell'anemone (Anemone coronaria L.)
Approvato con D.M. 11071 del 07/05/09

Contributo concesso € 216.800,00, pari a 74% della spesa ammessa


SOGGETTO PROPONENTE

Azienda Biancheri Creations
Azienda Agricola Manuela Brea

 

COORDINATORE DEL PROGETTO

Dr. Andrea Allavena - CRA FSO Unità di ricerca per la floricoltura e le specie ornamentali

 

PARTNER COINVOLTI

Azienda Biancheri Creations
Azienda Agricola Manuela Brea
CRA-FSO - Unità di ricerca per la floricoltura e le specie ornamentali

 
Ibridi di Anemone

PRESENTAZIONE DEL PROGETTO

 L'anemone da fiore reciso è suscettibile a numerose malattie causate da agenti fungini (Botrytis cinerea, Plasmophora pygmaea, Collettotrichum spp, Phytophthora cactorum Erysiphe polygoni, Pythium sp, Rhizoctonia solani, Tranzschelia discolor, Sclerotinia sclerotiorum, Sclerotium rolfsii) e virali: Cucumber mosaic virus (CMV, Cucumovirus), Tobacco necrosis virus (TNV, Tombusvirus), Impatiens necrotic spot virus (INSV, Tospovirus), Tomato spotted wilt virus (TSWV, Tospovirus), Tobacco rattle virus (TRV, Tobravirus), Raspberry ringspot virus (RRSV, Nepovirus) Ranunculus white mottle virus (RWMV, Ophiovirus), Anemone mosaic virus (AMV, Potyvirus), Turnip mosaic virus (TuMV, Potyvirus), Tobacco ringspot virus (TRSV, Nepovirus). I virus TRV e RRSV sono stati identificati in piante di Anermone japonica nella Germania meridionale e nell'Italia nord-occidentale (Lisa V. et al., 2002). I due Tospovirus TSWV e INSV possono essere responsabili di uno stato di malattia molto grave, con sviluppo di macchie necrotiche sulla foglia. Nel 1999 è stata diagnosticata per la prima volta un'infezione di RWMV in A.coronaria, su piante che apparivano poco sviluppate e con le foglie  giovani arricciate, deformate e con spot necrotici (Vaira et al., 2000);  questo virus spesso si presenta come infezione mista con il CMV. L'AMV è un TuMV che è stato isolato in A.coronaria e le piante infette presentano foglie chiazzate e fiori distorti (Hollings H., 1957).
La diagnosi precoce, nei vivai di produzione dei rizomi ed a campione sui rizomi da destinare alla coltivazione, rappresenta per buona parte delle malattie indicate una buona norma per garantire la sanità delle coltivazioni ed evitare l'utilizzazione di trattamenti chimici costosi in termini di salute umana e di contaminazione ambientale.
Situazione attuale del miglioramento genetico. Per scegliere la strategia di miglioramento dell'anemone, gli ibridatori devono tenere in considerazione le caratteristiche della specie: allogamia, proteroginia, depressione da autofecondazione, una generazione per anno (da seme a seme), valutazione agronomica utilizzando tuberi di un anno, soddisfacente produzione di seme, difficoltà di clonare in vivo le piante di anemone a causa di problemi fitosanitari, scarsa variabilità genetica per caratteri di rilevante importanza economica (es. resistenze alle malattie). Il fattore che ha giocato un ruolo determinante sulle scelte degli ibridatori è stato l'importanza limitata della specie. In Provincia di Imperia la superficie coltivata ad anemone è stata stimata nel 2009 in 22 ettari complessivi di cui 5 in serra. Tuttavia è attendibile un aumento di importanza di A. coronaria a causa delle basse esigenze termiche, sempre che vengano affrontate alcune problematiche: la sanità dei materiali di propagazione ed il miglioramento varietale.
Le cvs attualmente in uso sono distinte in sub-cvs caratterizzate da una discreta uniformità del colore dei fiori; tuttavia altri caratteri come la produttività, la precocità e la qualità dei fiori mostrano una evidente variabilità che è il frutto delle due forze che indirizzano l'attività di breeding: A) mantenere un elevato livello di vigore, B) fornire un prodotto uniforme. I semi delle sub-cvs sono preparati incrociando piante di famiglie geneticamente lontane e queste famiglie sono mantenute mediante incroci tra piante sorelle. Le piante all'interno di una famiglia sono geneticamente diverse e parzialmente eterozigoti. Infine i lotti commerciali di seme di ciascuna sub-cvs sono preparati mescolando incroci diversi. Per le ragioni sopra riportate le sub-cvs sono popolazioni di piante le cui caratteristiche genetiche possono variare negli anni.
Una strategia utilizzata in Francia per migliorare la robustezza degli steli e la dimensione dei fiori dell'anemone è stata la poliploidizzazione. Meynet (1993) scrive che la varietà Tetranemone è una forma tetraploide di Wicabri. Tetranemone mostra, a confronto con il suo parentale, una maggiore lunghezza e robustezza degli steli, un maggiore spessore dei sepali ed un'aumentata dimensione dei fiori; la fioritura è ritardata in autunno (Goujon et al.1979). Jacob et al. (1997) hanno indotto tetraploidi in Mona Lisa ed hanno comparato Tetranemone, Mona Lisa tetraploide, l'ibrido (Tetranemone x Mona Lisa tetraploide) e le varietà diploidi originali. L'ibrido manteneva i vantaggi dei tetraploidi, era precoce quanto Mona Lisa e produceva un numero di fiori comparabile. Anche i genotipi triploidi cumulano la produttività delle cvs diploidi e mantengono i caratteri vantaggiosi dei tetraploidi (Goujon et al.1979). La tetraploidia è stata utilizzata anche per l'ottenimento della varietà Mistral Plus (comunicazione del costitutore).
L'introgressione di caratteri genetici interessanti, come ad esempio il colore giallo ed il portamento eretto delle foglie, è stato tentato incrociando A. coronaria con le specie mediterranee. Maia N., citato da Goujon et al. (1979), ha scoperto che la sterilità interspecifica rende impossibile il trasferimento di geni utili. Piante derivate da incrocio tra Tetranemone e A. x fulgens sono stati incapaci di produrre seme, sebbene entrambi i parentali fossero tetraploidi con un numero di cromosomi di 32 (Allavena A., dati non pubblicati).
La costituzione di veri ibridi F1 caratterizzati da maggiore uniformità e l'introduzione di nuovi caratteri come ad esempio il colore giallo dei tepali e nuove tipologie di fiore, sembrerebbero gli obiettivi principali del miglioramento delle varietà per fiore reciso. Relativamente alle piante da vaso resta fondamentale la riduzione della lunghezza dei piccioli fogliari e degli steli fiorali e la concentrazione della fioritura. Alla luce dell'attuale disponibilità di variabilità genetica sembra alquanto difficile intervenire sull'allungamento della vita commerciale dei fiori utilizzando metodi convenzionali di miglioramento.

 
Danni da T. discolor su A. coronaria

OBIETTIVI e RISULTATI ATTESI

 L'obiettivo generale del progetto è la valorizzazione dell'anemone in quanto specie ornamentale adatta alla coltivazione nelle condizioni climatiche delle aree mediterranee. La specie non ha ancora trovato spazio nelle aree di coltivazione extra europee tipiche della delocalizzazione delle produzioni floricole. La ricerca potrebbe avere quindi una ricaduta principalmente a livello europeo ed italiano. L'obiettivo generale si attua mediante azioni a tre livelli per il raggiungimento di obiettivi specifici:
· Miglioramento varietale;
· Messa a punto di mezzi diagnostici molecolari per la verifica sanitaria dei materiali di propagazione e per la prevenzione dello sviluppo di malattie nelle coltivazioni;
· Caratterizzazione molecolare e costituzione di una mappa genetica per agevolare le attività future di miglioramento.

 

STATO DI AVANZAMENTO

 Miglioramento varietale
L'attività preliminare per iniziare l' attività di miglioramento genetico è stata la collezione di germoplasma di A. coronaria. Complessivamente sono state reperite le vecchie varietà appartenenti alle tipologie De Caen (Hollandia, Fokker, Sylfide, The Bride, His Excellency) e St. Brigid (The Admiral, The Governor, Lord Lieutenant, Mount Everest), le varietà più recenti (Wicabri e Mona Lisa), le classiche varietà Italiane (Cristina e Mistral), le varietà israeliane, (Jerusalem, Galilee, Meron, Carmel) e le varietà tetraploidi (Tetranemone e Mistral Plus, rispettivamente di origine francese ed italiana). Ciascuna varietà si caratterizza per alcuni caratteri distintivi. Per il miglioramento genetico dell'anemone sembrano essere importanti la precocità di fioritura che caratterizza le varietà israeliane, la robustezza degli steli e la dimensione dei fiori delle varietà italiane e l'abbondanza dei fiori prodotti tipiche delle vecchie varietà.
Considerata la scarsa uniformità delle cultivars di anemone attualmente coltivate, sono stati proposti  alle Aziende schemi di incrocio alternativi a quello comunemente utilizzato e descritto in premessa. Gli schemi proposti sono descritti da Laura e Allavena (2007) e si basano sulla disponibilità di tecniche in vitro per la produzione di piante androgenetiche a partire da coltura di antere (Laura et al., 2007) e di tecniche di ambientamento in vitro e micropropagazione di semi o espianti di piante adulte (Ruffoni et al., 2005). Un primo schema  di incrocio prevede: la produzione di piante androgenetiche; l'identificazione di cloni auto reduplicati o duplicati in conseguenza di trattamenti con agenti specifici come ad esempio la colchicina; l'utilizzazione delle piante diplo-aploidi per la costituzione degli ibridi. Gli ibridi F1 derivati, opportunamente selezionati sulla base delle loro caratteristiche agronomiche ed ornamentali, garantiscono la massima uniformità genetica. I maggiori problemi posti da questo schema riguardano l'identificazione di numerose linee androgenetiche diplo-aploidi fertili e provenienti da parentali geneticamente lontani da utilizzate per la costituzione degli ibridi. Un secondo schema prevede l'incrocio di cloni di piante conservate e moltiplicate in vitro. Tali cloni (parentali) possono essere derivati da piante identificate in campo e quindi caratterizzate da un punto di vista morfologico oppure derivate dalla micropropagazione di semenzali germinati in vitro. Mediante incroci diallelici ed analisi delle progenie viene valutata l'attitudine combinatoria generale e specifica di ciascun parentale. Le progenie prodotte dagli incroci selezionati saranno più uniformi delle attuali popolazioni anche se non raggiungeranno l'uniformità degli ibridi F1. La disponibilità dei parentali in vitro garantisce, negli anni, il mantenimento delle caratteristiche delle varietà. Questo schema di incrocio permette anche di accorciare i tempi di costituzione di nuove varietà con caratteristiche rinnovate per specifici caratteri (ad esempio la precocità) utilizzando come parentali individui provenienti da varietà preesistenti.
Messa a punto di mezzi diagnostici molecolari
La Ruggine dell'anemone, causata da Tranzschelia discolor è diventata, negli ultimi anni, un grave problema per le coltivazioni di anemone, in particolare sulle varietà tetraploidi. Durante il ciclo vitale per produrre rizomi a partire da seme, le piantine di anemone vengono infettate dalle teleutospore che si formano sulle foglie di specie del genere Prunus (Bolay A. e Siegfried W., 1991) (Fig. 1); le piante infette rimangono asintomatiche e la malattia si manifesta nel ciclo vegetativo successivo sulle piante coltivate per la produzione di fiori recisi. L'infezione da parte di T.discolor produce un lussureggiamento della pianta e riduce in modo drastico la produzione e la qualità dei fiori (Fig. 2). Le ecidiospore rilasciate dalle foglie di Anemone (Fig. 3) infettano solo il Prunus. La possibilità di individuare il fungo patogeno nei tessuti dei bulbi infetti, rappresenta il miglior metodo per il controllo della malattia. La diagnostica di T.discolor è stata condotta utilizzando la tecnica PCR (polimerase chain reaction). In parallelo è stata messa a punto la tecnica LAMP ( loop-mediated isothermal amplification) che permette di amplificare specifici tratti di DNA di un organismo in condizioni isotermiche. Come materiale vegetale di partenza per l'estrazione di DNA sono stati utilizzati rizomi e foglie fresche di A. coronaria. Il DNA genomico è stato estratto utilizzando un kit commerciale (QIAGEN). I primers per le reazioni di amplificazione sono stati disegnati su sequenze di T. discolor disponibili in banca dati (18S rRNA, ITS1, 5.8S rRNA, ITS2, 28S rRNA). Le reazioni di PCR sono state effettuate in un termociclatore T gradient thermal cycler (Biometra) usando condizioni appropriate. Per verificare la specificità della reazione, i prodotti di amplificazione sono stati recuperati per il sequenziamento. Per l'analisi LAMP, sono stati utilizzati anche estratti di sezioni di rizoma trattate con un buffer specifico per rendere disponibile il DNA del patogeno. La reazione LAMP è stata condotta  oltre che in un termociclatore anche in un semplice  termoblocco a temperatura costante. I prodotti LAMP sono stati visualizzati su gel di agarosio, con l'etidio bromuro, o direttamente in tubi Eppendorf, usando la calceina o l'hydroxynaphtol blue. Sia la tecnica della PCR che della LAMP hanno permesso di identificare la presenza del fungo T.discolor in rizomi apparentemente sani (Fig.4). La metodica della LAMP ha consentito di rilevare la presenza del patogeno direttamente dal tessuto senza la necessità di estrarne il DNA. La LAMP inoltre non ha richiesto l'uso di apparecchiature da laboratorio sofisticate poiché la reazione di amplificazione è avvenuta in modo isotermico in un comune termoblocco riscaldante. La positività del campione è stata visualizzata direttamente nei tubi Eppendorf, sotto forma di precipitato, mediante l'aggiunta nel buffer di reazione di calceina, o mediante osservazione con luce blu in presenza di hydroxynaphtol blue. La totale concordanza tra i dati ottenuti con la PCR e con la LAMP permette di affermare che quest'ultima tecnica può essere utilizzata in sostituzione della prima in particolare per test veloci di campo quando l'estrazione del DNA ritarderebbe la diagnosi.
Per la diagnostica dei virus è stata utilizzata la tecnica RT-PCR. Poiché tutte le specie virali menzionate possiedono un genoma ad RNA, dalle piante infette è stato estratto l'RNA totale mediante Kit commerciali (QIAGEN); dall'RNA è stato poi retrotrascritto il cDNA che è servito da materiale di partenza  per la reazione di PCR. Coppie di primers specifiche sono state disegnate, mediante il software primer-BLAST http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/, sulla base delle sequenze depositate, per ciascun virus, nel database dell'NCBI. Per alcuni virus è stato possibile utilizzare anche dei primer già presenti in letteratura. La specificità primers è stata testata su controlli positivi costituiti da piante sicuramente infette oppure mediante sequenziamento del prodotto di amplificazione e confronto con le sequenze attese. In Tab. 1 sono riportati i primers validati per la diagnostica di tre virus di anemone.
Caratterizzazione molecolare
Il rapido evolversi delle tecniche molecolari e la possibilità di effettuare il sequenziamento del genoma di anemone in un progetto diverso, anch'esso finanziato dal MiPAAF, ha fornito l'opportunità di utilizzare marcatori molecolari di tipo SNP, InDel ed SSR per la caratterizzazione molecolare di anemone e la costituzione di una mappa genetica in sostituzione dei marcatori di tipo AFLP previsti al momento della stesura del progetto. Il vantaggio dell'utilizzazione di marcatori SNP, InsDel ed SSR  risiede nella co-dominanza, nella relativa abbondanza e nella elevata conservazione all'interno di una specie. I polimorfismi SNP ed InDel sono inoltre diffusi in tutto il genoma comprese le sequenze codificanti e di conseguenza possono essere utilizzati per distinguere alleli e per attuare la selezione assistita da marcatori funzionali. Sono tuttora in corso le analisi bioinformatiche delle sequenze per individuare i marcatori da utilizzare. In parallelo è stata preparata la progenie segregante necessaria per la costituzione della mappa genetica di anemone.

 
Test diagnostico utilizzando la tecnica LAMP; la fluorescenza indica la presenza del patogeno nella pianta

RISULTATI RAGGIUNTI

Il progetto ha permesso di mettere a disposizione delle Aziende la maggior parte delle varietà conosciute differenziate per importanti caratteri ornamentali ed agronomici tra cui la precocità, tipica delle varietà israeliane, e la produzione di numerosi fiori che distingue le varietà antiche. Alle aziende sono stati inoltre proposti due schemi di miglioramento genetico che possono portare o alla costituzione di ibridi F1 a partire da linee pure androgenetiche o all'ottenimento di varietà più uniformi delle attuali popolazioni incrociando parentali eterozigoti conservati in vitro. Questo secondo schema di incrocio può condurre, in pochi anni, alla costituzione di nuove varietà migliorate per caratteri di rilevante importanza agronomica ed ornamentale e garantire uniformità delle cvs nel corso degli anni. La disponibilità di tecniche molecolari ha permesso di mettere a punto, per alcune malattie, procedure diagnostiche basate sulla PCR. Inoltre per Tranzschelia discolor è stata validata la tecnica di diagnostica LAMP che non richiede l'utilizzazione di sofisticate attrezzature di laboratorio come i termociclatori o i transilluminatori. Tale tecnica è applicabile in campo per saggi veloci utilizzando piccoli frammenti del tessuto da saggiare anche in assenza di estrazione di DNA. La tecnica LAMP potrà essere estesa alla diagnostica di altri patogeni.
L'attività svolta nel progetto ANEMOS affronta problematiche applicative del miglioramento genetico, convenzionale ed assistito da marcatori, e della diagnostica. E' stato possibile programmare e sviluppare le attività sopra indicate perché l'UO ha potuto acquisire conoscenze specifiche nel campo della biologia molecolare nell'ambito di progetti di ricerca precedenti (AGRONANOTECH) ed in corso (ESPLORA).

 

AZIONI DI DIVULGAZIONE

Convegno:Miglioramento genetico e valorizzazione di nuovi genotipi nel florovivaismo Italiano; i contributi dal bando MiPAAF "Imprese Florovivaistiche" (D.M. 186/2007). Pescia, 13 Marzo 2012
Allavena A. Nuove tecnologie per la valorizzazione dell'anemone (Anemone coronaria L.)" comunicazione orale
Fiera di Padova: FLORMART Salone internazionale del florovivaismo e giardinaggio Settembre 2011
Allavena A. Nuove tecnologie per la valorizzazione dell'anemone (Anemone coronaria L.)" Poster

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