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Piani di Settore
 

Bando prt. n. D.M. 186 del 1° agosto 2007
G.U. n. 208 del 07/09/2007

 

PSTVd-FREE

Interventi strategici per la difesa del vivaismo ornamentale nei confronti di potato spindle tuber viroid (PSTVd) e di altri agenti viroidali
Approvato con D.M. 11077 del 07/05/09; D.M. 14871 del 26/06/09; D.M. 11010 del 17/06/10

Costo totale € 413.743,80 - Contributo concesso € 202.650,00


SOGGETTO PROPONENTE

ALTIFLOR s.a.s.

 

COORDINATORE DEL PROGETTO

Dr. Francesco Faggioli - CRA PAV Centro di ricerca per la patologia vegetale

 

PARTNER COINVOLTI

CRA PAV - Centro di ricerca per la patologia vegetale
CNR IVV - Istituto di virologia Vegetale
CRSA - Centro di Ricerca e Sperimentazione in Agricoltura

 

PRESENTAZIONE DEL PROGETTO

La presenza del viroide del tubero fusiforme della patata (Potato spindle tuber viroid, PSTVd) nel settore del vivaismo ornamentale, in particolare in Solanum jasminoides, é stata segnalata per la prima volta nel 2006 in Europa e nel 2007 in Italia. La problematica fitosanitaria ha poi assunto una crescente importanza e lo stato di allerta generalizzato, scaturito dalle continue segnalazioni di infezioni di PSTVd in solanacee ornamentali, ha indotto i servizi fitosanitari di molti Paesi Europei (Germania, Olanda, Danimarca) a richiedere il certificato "PSTVd-free" per l'esportazione di piante o del materiale di propagazione. Anche in Italia, con il D.M. 28/01/2008 , è stata introdotta la lotta obbligatoria al PSTVd su S. jasminoides e Brugmansia spp. Il progetto si è focalizzato sul miglioramento delle conoscenze sul binomio PSTVd/ornamentali e la messa a punto di un modello operativo aziendale per la produzione di piante di S. jasminoides viroide-free. La prima linea di ricerca ha previsto l'allestimento di una collezione di isolati di Pospiviroids provenienti sia dai monitoraggi che da collezioni di altri istituti di ricerca e il monitoraggio della diffusione del patogeno e di altri organismi da quarantena, soprattutto nelle regioni vocate all'attività florovivaistica, con conseguente caratterizzazione molecolare degli isolati rinvenuti. Sono state allestite prove sperimentali con piante sane ed infette per verificare le modalità di trasmissione del PSTVd in popolazioni di S. jasminoides grazie a normali tecniche colturali e l'eventuale influenza agronomica/produttiva di questo patogeno. Sono state, inoltre, previste anche prove sperimentali di inoculazione del viroide per la valutazione del rischio di diffusione su solanacee di interesse agrario e per l'identificazione di potenziali ospiti tra le specie ornamentali. La seconda linea di ricerca è stata incentrata sulla messa a punto e validazione di un efficiente metodo diagnostico per l'identificazione del patogeno sia testando protocolli diagnostici già presenti in letteratura che producendone ad hoc per questa problematica. Sulla base dei risultati ottenuti la terza linea di ricerca ha previsto la predisposizione di uno schema di certificazione  per la produzione di piante PSTVd-free,  l'effettuazione di un ring test per il confronto dell'efficienza dei metodi diagnostici ed è stato valutato il rischio fitosanitario associato alla presenza di PSTVd

 

STATO DI AVANZAMENTO e RISULTATI RAGGIUNTI

 Attualmente, la collezione dei viroidi è così costituita:
- 25 isolati di PSTVd da S. jasminoides, L. rantonnetii, pomodoro, patata, Cestrum sp.
- isolati di CLVd, MPVd, TPMVd, TCDVd, IrVd (Dottor Verhoeven J.Th.J. Università di Wageningen - The Netherland) da pomodoro
- TASVd da S. jasminoides e Cestrum sp.
- CEVd da S. jasminoides e Cestrum sp.
- CSVd da crisantemo e margherita (Dendranthemum morifolium, Argyranthemum frutescens)
- PSTVd + CEVd da S. jasminoides e Cestrum sp.
- PSTVd + TASVd da S. jasminoides
- CEVd + TASVd da S. jasminoides
 
Il sistema di controlli diagnostici messi in atto nell'ambito di questo progetto ha permesso di ridurre la presenza di PSTVd dal 40% (2009) al 10% (2010) sul territorio. Le indagini hanno inoltre permesso di evidenziare un'elevata presenza del genere Pospiviroid in Italia; di individuare nuovi ospiti di PSTVd (Cestrum e L. rantonnetii); di rilevare un'endemizzazione di CEVd su S. jasminoides (presente sul 90% dei S. jasminoides analizzati); di effettuare la prima segnalazione della presenza di TASVd in Italia; di rilevare doppie infezioni PSTVd + CEVd nel 2010 su Cestrum sp., nel 2011 su S. jasminoides; TASVd + PSTVd nel 2010 su S. jasminoides; CEVd + TASVd nel 2011 su S. jasminoides.
L'attività svolta per verificare le possibili modalità di trasmissione dell'infezione da piante infette a piante sane, non ha fornito ad oggi informazioni in merito in quanto nessuna pianta di S. jasminoides è risultata aver acquisito PSTVd nelle prove di trasmissione intraspecifica avviate utilizzando potatura, inoculazione e contatto radicale. Inoltre, i progressi ottenuti nella messa punto dei metodi diagnostici per PSTVd e per il gruppo Pospiviroid ha messo in evidenza la presenza sulle piante utilizzate nelle prove stesse di un altro viroide (CEVd). E' necessario a questo punto effettuare con prove sperimentali specifiche una verifica sulla possibilità di azioni di cross-protection tra i due viroidi e ripetere le prove di trasmissione con piante totalmente esenti da tutti i viroidi ma che al momento sembrano, per le indagini svolte, di difficile ritrovamento. 
Nel valutare il rischio fitosanitario per le solanacee ortive, tutte e quattro le specie (pomodoro, patata, melanzana e peperone) utilizzate hanno acquisito artificialmente l'infezione da PSTVd. In particolare pomodoro e peperone hanno evidenziato sintomi fogliari evidenti mentre patata e peperone hanno mostrato alterazioni morfologiche a carico dei tuberi e bacche, rispettivamente. L'infezione su melanzana è di tipo asintomatico per cui è stata accertata solo mediante le analisi di laboratorio.
Tra le solanacee ornamentali sono risultate suscettibili all'infezione artificiale Surfinia spp., Solandra maxima, Datura inoxia, L. rantonnetii con tempi diversi di latenza. Della sola specie Datura sp. sono stati ottenuti i frutti ed i semi. Sub-campioni macerati di questi ultimi e piantine prodotte da altri sono stati controllati e risultati esenti da PSTVd.
Dopo circa due anni di osservazioni delle piante di S. jasminoides oggetto di valutazione agronomica, non sono mai state riscontrate differenze significative tra piante infette e piante sane nella crescita, nella produzione ed emissione di tralci ed infiorescenze, nella capacità di radicazione e produzione di nuove piantine dalle talee semilegnose prelevate. Anche la distribuzione del viroide nelle piante infette non ha evidenziato variabilità nei diversi periodi dell'anno ma la presenza del viroide nelle foglie apicali o dei giovani getti laterali di un ramo non è sempre rilevata. Ne consegue che il campionamento ai fini di accertamenti fitosanitari deve prevedere sempre il prelievo di foglie adulte ben sviluppate nella parte centrale dei rami.
Lo studio delle sequenze ottenute dagli isolati di PSTVd da diversa matrice ha evidenziato dei polimorfismi isolati da patata, S. jasminoides e Cestrum spp. Gli isolati di PSTVd di S. jasminoides hanno mostrato una patogenicità su pomodoro comparabile a quella dei ceppi 'intermediate-severi' previamente descritti in letteratura la variante PSTVd-SjT non si modifica significativamente quando infetta pomodoro (Navarro et al., 2009), questi risultati indicano che PSTVd in S. jasminoides potrebbe aver avuto differenti origini epidemiologiche. Invece, le analisi condotte sui campioni di A. frutescens hanno evidenziato una bassa variabilità di sequenza di CSVd negli isolati italiani appartenenti alla famiglia delle Asteraceae. Le varianti italiane di CSVd sono molto simili ad alcune varianti dello stesso viroide isolate dalla stessa specie nel 2011 in Francia (Marais and Faure, 2011).
La messa a punto di un metodo valido d' identificazione specifica di PSTVd è stata ottenuta con un protocollo di one step RT-PCR  seguito da RFLP individuando un sito di restrizione e relativo enzima, Alu I endonucleasi, in grado di discriminare i campioni infetti da PSTVd da quelli infetti da TASVd con una sola analisi. Il saggio molecolare in real time qRT-PCR è risultato particolarmente sensibile, specifico e riproducibile nell'individuare la presenza di PSTVd nei campioni anche con basse concentrazioni viroidali.
E' stato messo anche a punto un metodo di diagnosi di tipo universale per il genere Pospiviroid che consente di rilevare la presenza di 9 specie su 10 di pospiviroids, su diverse specie vegetali discriminandole mediante RFLP (uso combinato di due endonucleasi di restrizione AluI e Sau96I). Questo metodo consente anche di identificare doppie infezioni: PSTVd + CEVd; PSTVd + TASVd; CEVd + TASVd. I metodi diagnostici di RT-PCR con RFLP e Real time RT-PCR sono stati validati con successo in prove condotte presso le UU.OO per gli aspetti di sensibilità, specificità e accuratezza e con il ring-test per la riproducibilità. Questi metodi saranno parte integrante del protocollo di diagnosi definitivo. E' stata anche prodotta una poliribosonda valida per la diagnosi contemporanea, su larga scala, mediante tissue printing o dot-blot, di 9 pospiviroidi. Sono in corso esperimenti per la validazione della stessa. 
Il primo obiettivo per la realizzazione di uno schema di certificazione è stato raggiunto con la costruzione di una serra a prova d'insetti (screenhouse) presso l'azienda Altieri (settembre 2010). Dopo gli opportuni controlli fitosanitari per PSTVd e altri viroidi, si dispone ora del nucleo di pre-moltiplicazione delle piante di fonte primaria del materiale di propagazione vegetativa (talee) da sottoporre a controlli annuali. Da esse sono state ottenute le piante madri (500-600), anch'esse controllate annualmente, ed allevate in ambiente separato. Le talee da esse ottenute hanno consentito in questi due anni l'avvio di produzioni certificate di S. jasminoides destinate alla vendita con controlli random nell'ordine del 5%.
Il rinvenimento di PSTVd in Liguria, su pomodori coltivati in prossimità di solanacee ornamentali asintomatiche ed infette dallo stesso viroide, rappresenta la prima evidenza di trasmissione naturale di PSTVd da Solanaceae ornamentali asintomatiche su colture orticole, quando non vengono applicate adeguate misure di profilassi.
Il ritrovamento di una forte prevalenza di CEVd in S. jasminoides in Italia suggerisce che la strategia di concentrare il controllo su PSTVd potrebbe favorire la diffusione di altri pospiviroidi ugualmente dannosi per patata e pomodoro ma non sottoposti a quarantena (Torchetti et al., SIPaV S1-25, 2011). Sulla base di questi dati, in futuro, si dovrebbero probabilmente prevedere misure di profilassi alternative.
L'identificazione di CEVd e TASVd in S. jasminoides e di CSVd su A. frutecens (e degli altri pospi identificati dal CRA) pone anche la questione di come affrontare la diffusione di questo viroide dannoso per il crisantemo (ma probabilmente anche per patata e pomodoro) in presenza di una legislazione specificamente rivolta a limitare la sua diffusione in crisantemo (Dentranthema spp.)
I dati generati dalle attività descritte dimostrano che infezioni miste di viroidi in S. jasminoides sono più frequenti di quanto si potesse pensare prima. Inoltre, il diverso livello di accumulo dei due viroidi nelle infezioni miste CEVd-PSTVd nello stesso ospite, impedisce il rilevamento di queste doppie infezioni con primer generici per pospiviroidi e rende necessarie l'applicazione di metodi alternativi.

 

AZIONI DI DIVULGAZIONE

Il 25 maggio 2012 è stato organizzato un Convegno divulgativo di tutti i risultati del Progetto dal titolo: "Potato spindle tuber viroid nel settore del vivaismo ornamentale: risultati di tre anni di ricerca e messa a punto di un modello di gestione aziendale certificante per piante viroid-free" (si allega il programma del Convegno).
Inoltre tutti i risultati ottenuti nell'ambito del progetto sono stati inseriti nelle seguenti pubblicazioni:
Di Serio F., Navarro B., 2010. Viroidi: una classe di patogeni emergenti poco nota. Protezione delle colture. n. 4: 2-8.
Di Serio F., Torchetti E.M., Flores R., Navarro B. (2012) The role of plant viroids in diseases - new developments. CAB Reviews 7: 1-9. doi: 10.1079/PAVSNNR20127006.
Di Serio F., Torchetti E.M., Navarro B., 2011. I viroidi delle colture ornamentali: emergenze fitosanitarie e misure di controllo. Quaderni dell'Accademia deiGeorgofili, submitted.
Di Serio F., Torchetti E.M., Navarro B., 2012. I viroidi delle colture ornamentali: emergenze fitosanitarie e misure di controllo. Quaderni dell'Accademia dei Georgofili (in press).
Flores R., Di Serio F., Navarro B., Duran-Vila N., Owens R.A., 2011. Viroids and viroid diseases of plants. In: Studies in Viral Ecology, Volume One: Microbial and Botanical Host Systems. (Ed: Christon J. Hurst) John Wiley & Sons,, pp: 311-346.
Luigi M, Luison D., Tomassoli L., Faggioli F. 2011. Diffusion and molecular analysis of Pospiviroids on ornamental plants in Italy. Journal of Plant Pathology, 93 (2): 491-495.
Luigi M, Luison D., Tomassoli L., Faggioli F., 2010. First report of Potato spindle tuber and Citrus exocortis viroids in Cestrum spp. in Italy. New Disease Report, Volume 23 (on line).
Navarro B., Silletti M.R., Trisciuzzi V.N., Di Serio F., 2009. Identification and characterization of Potato Spinale Tuber Viroid infecting tomato in Italy. Journal of Plant Pathology, 91 (3), 723-726.
Silletti M.R., Navarro B., Bozzano G., Trisciuzzi V.N., Di Serio F., 2009. Il viroide PSTVd minaccia pomodoro e patata.  L'informatore agrario, n.11, 89-90.
Sorrentino R., Torchetti E.M., Navarro B., Ragozzino E., Di Serio F., Alioto D., 2011. Citrus exocortis viroid infecting twenty year old Solanum jasminoides plants in Italy. Journal of Plant Pathology, 93 (4, Supplement), S4.89 (Disease note).
Torchetti E.M., Navarro B. and Di Serio F., 2012. A single polyprobe for detecting simultaneously eight pospiviroids infecting ornamentals and vegetables.  Journal of Virological Methods (in press)
Torchetti E.M., Navarro B., Cillo F., Di Serio F., 2010. Synergistic interaction between Potato spindle tuber viroid and Cucumber mosaic virus in tomato. Journal of Plant Pathology, 92 (4, Suppl.), S4.103 (Abstr.)
Torchetti E.M., Navarro B., Di Serio F., 2011. First record of Citrus exocortis viroid infecting Solanum jasminoides in Italy. Journal of Plant Pathology, 93 (Suppl.) DISEASE NOTE in press.
Torchetti E.M., Navarro B., Trisciuzzi V.N., Nuccitelli L., Silletti M.R., Di Serio F. (2012). First report of Chrysanthemum stunt viroid in Argyranthemum frutescens in Italy. Journal of Plant Pathology 94 doi: 10.4454/JPP.FA.2012.032. (in press).
Torchetti E.M., Navarro B., Trisciuzzi V.N., Silletti M.R., Di Serio F., 2011. Mixed viroid infections of Solanum jasminoides in Italy. Journal of Plant Pathology, 93 (4, Supplement), S4.61. (Abstr.) doi: 10.4454/jpp.v93i4.2359
Torchetti E.M., Navarro B., Trisciuzzi V.N., Silletti M.R., Di Serio F., 2011. Identification and characterization of Chrysanthemum stunt viroid infecting Argyranthemum frutescens in Italy. Journal of Plant Pathology, 93 (4, Supplement), S4.60. (Abstr.) doi: 10.4454/JPP.FA.2012.032.
O presentati a congressi:
Costantini E., Luigi M., Luison D., Mangiaracina P., Albanese G., Tomassoli L., Faggioli F. 2011. Diagnosis, characterization and diffusion of Pospiviroids on ornamental plants in Italy. Atti del XVII Convegno Nazionale SIPAV, 12-14 Settembre, Bologna:16.
Luigi M. e Costantini E., 2012. La diagnosi per il rilevamento specifico di PSTVd e generico per i Pospiviroidi: amplificazione genica. Convegno di Sabaudia, 25 maggio 2102
Luigi M., Costantini E., Luison D., Mangiaracina P., Tomassoli L. and F. Faggioli, 2012. Use of an improved RT-PCR/RLFP method for Pospiviroids detection and differentiation in ornamental plants in Italy. Proceedings of the 13th International Symposium on Virus Diseases of Ornamental Plants, Norway, 24 - 29 June, p. 25.
Luigi M., Navarro B., Siletti M.R. , Torchetti E.M. , Costantini E., Luison D., Mangiaracina P., Trisciuzzi V.N.,  Altieri L., Tomassoli L., Di Serio F. , Faggioli F. 2011. The Potato spindle tuber viroid threat: studies on its detection, characterization, transmission, diffusion, risk assessment and control strategies in the frame of the "PSTVd-free" Project. Atti del XVII Convegno Nazionale SIPAV, 12-14 Settembre, Bologna:18.
Luison D., Mangiaracina P., Costantini E., Luigi M., Faggioli F. and Tomassoli L., 2012. Facilitative and antagonistic interactions among pospiviroids infecting solanaceus ornamentals. Proceedings of the 13th International Symposium on Virus Diseases of Ornamental Plants, Norway, 24 - 29 June, p. 26.
Navarro B., Silletti M.R., Trisciuzzi N., Di Serio F., 2009. Identification and characterization of potato spindle tuber viroid infecting tomato in Italy. Atti del XIV Congresso SiPaV Locorotondo (BA) 28 settembre - 1 ottobre 2009 Journal of Plant Pathology, 91 (4, Suppl.), S4.75
Tomassoli L. e Luison D., 2012. Aspetti biologici di PSTVd e altri pospiviroidi su piante ornamentali. Convegno di Sabaudia, 25 maggio 2102.
Torchetti E.M., Navarro B., Cillo F. and Di Serio F., 2010. Synergistic interaction between Potato spindle tuber viroid and Cucumber mosaic virus in tomato. Atti del XVI Convegno Nazionale Società Italiana di Patologia Vegetale, Firenze (Italia), 14-17 Sept 2010, S1-19
Torchetti E.M., Navarro B., Trisciuzzi V.N., Silletti M.R., Di Serio F.. Identification and characterization of Chrysanthemum stunt viroid infecting Argyranthemum frutescens in Italy. XVII Convegno Nazionale Società Italiana di Patologia Vegetale, Bologna (Italia), 12-14 Sept 2011. S5-13.
Torchetti E.M., Navarro B., Trisciuzzi V.N., Silletti M.R., Di Serio F.. Mixed viroid infections of Solanum jasminoides in Italy. Atti XVII Convegno Nazionale Società Italiana di Patologia Vegetale (SIPaV), Bologna (Italia), 12-14 Sept 2011, S1-25.
Press, Springer Protocols, Part II, Chapter 18: 231-244

CONTATTI

Dr. Luca Altieri - ALTIFLOR s.a.s.
Dr. Francesco Faggioli - CRA PAV Centro di ricerca per la patologia vegetale, Roma
Dr. Francesco Di Serio - CNR IVV Istituto di virologia Vegetale, Torino
Dr. Nicola Trisciuzzi  - CRSA Centro di Ricerca e Sperimentazione in Agricoltura, Locorotondo (BA)