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Piani di Settore
 

Bando D.M. prt. n. 186 del 1 agosto 2007
G.U. n. 208 del 07/09/2007

 

MUTAFLOR

Mutagenesi fisica per il miglioramento genetico di varietà commerciali, nelle specie ornamentali di geranio, gerbera e poinsettia.
Approvato con D.M. 11067/7643/09 del 07/05/2009

Importo totale € 329.778,66 - Contributo concesso € 82.448,38 pari al 50% della spesa ammessa


SOGGETTO PROPONENTE

Azienda Agricola Albani Vincenzo e Ruggieri Italina s.s.a.
CRA-FSO Consiglio per la Ricerca e la sperimentazione in Agricoltura, Unità di ricerca per la Floricoltura e le Specie Ornamentali
Dipartimento di Chimica Generale - Università di Pavia

 

COORDINATORE DEL PROGETTO

Annalisa Giovannini - CRA FSO Unità di ricerca per la Floricoltura e le Specie Ornamentali

 

PARTNER COINVOLTI

Azienda Agricola Albani Vincenzo e Ruggieri Italina s.s.a.
CRA FSO Unità di Ricerca per la Floricoltura e le Specie Ornamentali

 

PRESENTAZIONE DEL PROGETTO

La bellezza e la costante ricerca della novità sono i maggiori obiettivi da raggiungere per chi opera nel settore florovivaistico. Le innovazioni possono comprendere prodotti con nuove forme e colori, un maggiore adattamento alla coltivazione, una maggiore resistenza alle malattie. L'uniformità del prodotto e contemporaneamente la possibilità di scelta, da parte dell'utilizzatore finale, fra una vasta gamma di forme e colori, è spesso la chiave di successo di una nuova linea di varietà. La collaborazione fra istituzioni pubbliche (National Institute of Agronomic Research) ed aziende private (Associations for the improvementof horticultural plants), in Francia, ha portato all'ottenimento di 25 nuove varietà, attualmente commercializzate in Europa. Le più avanzate tecniche di miglioramento genetico offrono il vantaggio di migliorare alcune caratteristiche senza alterare profondamente il genotipo della varietà utilizzata come materiale di partenza ed in tempi più brevi rispetto al tradizionale metodo di incrocio. L'impiego della mutagenesi nel miglioramento genetico dei vegetali ha lo scopo di produrre mutazioni, cioè variazioni ereditarie utili. Le ricerche in questo campo iniziarono nel 1930 quando Stadler dimostrò l'effetto mutageno delle radiazioni nell'orzo e nel mais; oggi sono più di 2300 le varietà registrate ottenute per mutagenesi e fra queste 566 appartengono a specie ornamentali. Le colture di cellule e tessuti in vitro, sviluppate da Murashige e Skoog negli anni sessanta, hanno aiutato lo sviluppo delle conoscenze nel campo della biologia vegetale ed hanno trovato applicazioni pratiche nella diffusione della micropropagazione a scopi commerciali anche nelle specie ornamentali. La coltivazione dei tessuti vegetali in ambienti controllati ed asettici, e la potenzialità di rigenerare una pianta intera, a partire da una singola cellula, hanno presto fatto intravede la possibilità di utilizzare la variabilità naturalmente indotta (variabilità somaclonale) o inducibile nelle colture in vitro, in programmi di miglioramento genetico.
Le radiazioni ionizzanti (raggi gamma, raggi X e neutroni veloci) sono radiazioni che nell'impatto con la materia dissipano energia, una parte della quale rimuove elettroni dalle orbite degli atomi, determinando coppie di ioni formate dall'elettrone libero e dall'atomo da cui esso è derivato, che resta così carico positivamente. Per effetto di questo fenomeno di ionizzazine nell'acqua, che costituisce la maggior parte dei tessuti, si vengono a formare radicali liberi e perossidi che a loro volta possono provocare la rimozione di altri elettroni. Se una o più ionizzazioni  provocano danni al DNA si vengono a determinare delle mutazioni. Le principali alterazioni delle radiazioni comportano rottura dei legami idrogeno che legano le coppie di basi adenina-timina e citosina-guanina; l'induzione di rotture in una o in entrambe le catene del DNA tra zuccheri e gruppi fosfatici; la formazione di legami tra timine adiacenti sulla catena con formazione di dimeri; legami crociati tra i singoli strands dell'elica o tra uno strand ed un'altra molecola di DNA o tra uno strand e l'istone associato con il DNA nel cromosoma. Alcune aberrazioni strutturali che avvengono nei cromosomi sono dovute a singole rotture determinate da singoli eventi ionizzanti (one-hit aberration: mutazioni geniche, delezioni). Più ionizzanti sono le radiazioni maggiori effetti mutageni esse provocano. Per il miglioramento genetico delle piante sono normalmente sottoposti a trattamento mutageno i semi ed il polline e le parti della pianta che vengono adoperate per la loro moltiplicazione (talee, tuberi, bulbi, stoloni ecc.), parti in cui esistono ancora dei meristemi attivi, cellule indifferenziate totipotenti, in grado di dividersi e differenziarsi in un organo intero.
Il miglioramento genetico delle piante a propagazione vegetativa è stato spesso effettuato attraverso l'utilizzazione di mutazioni spontanee (sports). L'impiego della mutagenesi sperimentale ha lo scopo di aumentare la frequenza delle mutazioni somatiche. Le attuali tecniche biotecnologiche di propagazione vegetativa in condizioni controllate hanno contribuito ad aumentare la possibilità di ottenere nuove varietà nelle specie ornamentali, dove qualsiasi variazione può essere commercialmente sfruttabile. La possibilità di mutagenizzare cellule singole e rigenerare da esse piante complete in vitro ha aumentato la facilità di ricerca e selezione di mutanti. In genere si utilizza la mutagenesi quando si vuole migliorare una varietà per qualche determinata caratteristica, senza alterarne profondamente il genoma. Le mutazioni indotte sono di solito recessive e possono riguardare la bassa taglia, internodi accorciati, precocità di fioritura, riduzione della superficie fogliare, mutazioni che determinano maschiosterilità , che modificano la struttura ed il colore del fiore e dei semi. La mutazione rimane comunque un evento non prevedibile, ciò che può essere previsto è il rapporto tra mutazioni favorevoli e mutazioni totali ottenuti che è stimato intorno a 1:100 o a 1:1000, a seconda della specie e della metodologia seguita. La selezione ed individuazione della mutazione favorevole può essere velocizzata in un sistema in vitro in cui è possibile moltiplicare e portare a fioritura il germoglio vM1 (prima generazione dopo trattamento mutageno in piante a propagazione vegetativa).  La combinazione della coltura in vitro associata all'irraggiamento con raggi X è stata applicata con successo alla cultivar di rosa da fiore reciso "Iseta". Dopo solo 9 mesi dal trattamento dei germogli in vitro si sono ottenute le piante fiorite (Walter e Sauer, 1986).  La manipolazione delle condizioni di coltura (fotoperiodo, fitoregolatori, carboidrati, ecc.) può indurre i germogli micropropagati a fiorire direttamente in vitro (Vu et al., 2006). La tecnica dell'in vitro flowering è attualmente impiegata in Dendrobium per la selezione precoce sul colore dei fiori (Sim et al., 2007).

Le radiazioni ionizzanti sono una fonte di variabilità genetica e sono utilizzate, in combinazione con la rigenerazione in vitro, nel Mutation Breeding per ottenere piante con nuove caratteristiche ornamentali. Il miglioramento genetico basato sull'impiego di radiazioni ionizzanti è ritenuto una strategia promettente, ma richiede protocolli ottimizzati; pertanto, nuove informazioni utili a chiarire la risposta molecolare alle radiazioni ionizzanti potrebbero essere utilizzate per aumentare l'efficienza di mutazione e la produzione di nuove varietà. Nell'ambito del progetto MUTAFLOR è stata intrapresa una ricerca multidisciplinare con lo scopo di ottimizzare i protocolli di mutagenesi a radiazione gamma in specie da vaso fiorito micropropagate. L'attività di ricerca prevede l'utilizzazione di un approccio integrato fra la mutagenesi fisica e le biotecnologie, al fine di individuare un protocollo efficiente per indurre mutazioni a livello di DNA, in piante rigenerate in vitro e si basa su una stretta collaborazione fra il CRA (Unità di Ricerca per la Floricoltura e le Specie Ornamentali), l'Università di Pavia (Dipartimento di Chimica Generale) e la ditta proponente Albani e Ruggieri (Civitavecchia), con una ricaduta scientifica di alto valore sul piano dei risultati. 

 

OBIETTIVI E RISULTATI ATTESI

L'obiettivo principale del progetto MUTAFLOR è quello di individuare un sistema efficiente, rapido e relativamente economico per modificare una o poche caratteristiche ornamentali di varietà commerciali micropropagate, associando la tecnica di mutagenesi a radiazione gamma alla capacità di rigenerazione dei tessuti vegetali in vitro. L'applicazione della mutagenesi con le radiazioni ionizzanti a varietà pregiate si pone come obiettivo l'ottenimento di un'intera linea di piante con caratteristiche di accrescimento simili, ma differenti solamente per uno o pochi caratteri morfologici ad esempio il colore e la morfologia dei fiori o delle foglie, in modo da permettere all'azienda di soddisfare le crescenti esigenze dei clienti in materia di uniformità di prodotto, ovvero la possibilità di adattare la stessa pratica colturale a tutta una linea di piante, abbassando i costi di produzione. Gli obiettivi specifici da raggiungere sono quindi quelli di elaborare dei protocolli efficienti di mutagenesi e rigenerazione in varietà commerciali a propagazione vegetativa, fornite dalla ditta proponente. 
Le tecniche della rigenerazione di piante e della fioritura in vitro (in vitro flowering) permetteranno di effettuare una selezione precoce sul materiale vegetale trattato, al fine di identificare i genotipi con le caratteristiche desiderate (modificazione del colore del fiore e delle foglie). Il progetto prevede di ottenere delle varietà con nuove caratteristiche ornamentali.

 

STATO DI AVANZAMENTO e RISULTATI RAGGIUNTI

Tutte le attività di ricerca svolte nel progetto MUTAFLOR sono basate anche sulla collaborazione fra le Unità Operative ed il Dipartimento di Genetica e Microbiologia dell'Università di Pavia (Prof.ssa Alma Balestrazzi e collaboratori), specializzato nell'analisi degli effetti delle radiazioni ionizzanti sul materiale vegetale (Fig.1).
Messa a punto di un efficiente protocollo di rigenerazione in vitro: nella prima fase del progetto è stata valutata la capacità rigenerativa di varietà commerciali delle specie ornamentali Gerbera jamesonii (una varietà), Vinca major (due varietà), Pelargonium (sei varietà), Petunia x hybrida (tre varietà) e Calibrachoa (due varietà) micropropagate, fornite dalla ditta Albani e Ruggieri, esaminando per ogni genotipo il tipo di espianto più adatto (lamina o peduncolo fogliare) ed il substrato di rigenerazione con la più elevata efficienza di rigenerazione (numero di espianti con rigenerazioni e numero di germogli per espianto, rigenerati dopo un mese di coltura).Messa a punto delle condizioni di irraggiamento: per ottimizzare il protocollo di mutagenesi a radiazione γ sono state valutate la dose rate (bassa 0,33 Gy/min; alta 5,15 Gy/min) e la dose totale (25 Gy; 50 Gy) sul genotipo con la più elevata efficienza di rigenerazione in vitro.Studio dei meccanismi cellulari e molecolari attivati in risposta alle radiazioni: per esaminare l'effetto delle radiazioni sul tessuto fogliare sottoposto a mutagenesi sono stati valutati l'accumulo di perossido di idrogeno e del radicale superossido nei tessuti (ROS),  la mortalità cellulare, il danno ossidativo del DNA (stimato mediante comet assay), i profili di espressione di alcuni geni coinvolti nei meccanismi di riparo del DNA (ad esempio il gene 8-oxo-dG-glycosylase/lyase).Isolamento e selezione di linee mutagenizzate: dalla varietà di Petunia x hybrida con la più efficiente percentuale di rigenerazione, sottoposta al protocollo di mutagenesi, sono stati isolati e selezionati 22 germogli vM1, che sono stati ulteriormente propagati in vitro (Fig. 2), radicati ed ambientati in serra.Caratterizzazione genetica e fenotipica delle linee di Petunia x hybrida mutagenizzate: è stata intrapresa un'analisi basata sui marcatori molecolari RAPD per effettuare un profilo genetico dei germogli mutagenizzati, la "pianta madre" e un germoglio rigenerato da tessuto fogliare, non sottoposto a mutagenesi; le piante ambientate sono state inoltre coltivate in vaso, in pien'aria, presso il CRA-FSO, a Sanremo (Imperia), maggio-settembre 2011, per valutare le caratteristiche morfologiche (altezza, colore delle foglie e dei fiori, diametro dei fiori), la capacità di fioritura (data di fioritura, numero dei fiori per pianta, durata del fiore in antesi) e la capacità di produrre seme fertile da autofecondazione.  

Gli studi sulla capacità rigenerativa delle varietà commerciali micropropagate hanno permesso di identificare una varietà di Petunia x hybrida particolarmente efficiente, che è stata quindi utilizzata per ottimizzare le condizioni di irraggiamento e per studiare i meccanismi cellulari e molecolari attivati in risposta alle radiazioni γ. Le analisi effettuate su Petunia x hybrida hanno permesso di definire i valori di dose totale (25 Gy) e dose rate (0,33 Gy/min) per un tempo di esposizione di un'ora e mezzo, che consentono un'adeguata capacità rigenerativa (45%). I risultati ottenuti, applicando per la prima volta il saggio SCGE o comet assay a espianti fogliari di petunia, hanno permesso di valutare in modo rapido ed economico l'effetto genotossico dei trattamenti mutageni (Balestrazzi et al., in corso di stampa). Nelle specie Gerbera jamesonii, Vinca major e Pelargonium non è stato possibile individuare una varietà ad alta capacità rigenerativa e quindi idonea all'attività di in vitro breeding, mentre per un solo genotipo di Calibrachoa è stato messo a punto un substrato di rigenerazione da tessuto fogliare ottimale e sono in corso i trattamenti di mutagenenesi degli espianti. Le 22 linee di Petunia x hybrida ottenute applicando il protocollo di mutagenesi ottimizzato sono state valutate in condizioni standard di coltivazione per avere delle prime informazioni sull'effetto del trattamento mutageno sulle caratteristiche morfologiche e fisiologiche della prima generazione di piante (Giovannini et al., 2012). Una linea in particolare si è distinta dalle altre e dai controlli per avere un portamento compatto (altezza ridotta), fiori più grandi (diametro della corolla più grande) e non produrre semi, la stessa linea ha evidenziato un profilo genetico diverso dalle altre. I semenzali di alcune linee di Petunia x hybrida mutagenizzate sono attualmente in coltivazione per studiare gli effetti del trattamento mutageno nella progenie M2 derivata da autofecondazione. Alcune piante M2 della linea mutagenizzata di Petunia x hybrida vM1/I hanno evidenziato delle variazioni del colore della corolla dei fiori, dal fucsia della pianta madre al viola e al rosa pallido (Fig. 3). Presso la ditta Albani e Ruggieri sono in corso le prove di allevamento delle piante per poter valutare in campo, almeno per un ciclo produttivo (12 mesi), i nuovi genotipi; pertanto l'Azienda è coinvolta sia per saggiare "sul campo" sotto il profilo agronomico e commerciale i prodotti, sia per collaborare ad eventi di carattere dimostrativo essenziali nella fase finale di ricaduta del progetto.

 

AZIONI DI DIVULGAZIONE

I risultati delle attività finora svolte sono stati oggetto delle seguenti pubblicazioni:
Giovannini A., Nicoletti F., Dente F., Balestrazzi A., Donà M., Macovei A., Carbonera D., Ventura L., Buttafava A., Langhella R., Albani M. 2012. Mutagenesi fisica per il miglioramento genetico in varietà commerciali micropropagate. Acta Italus Hortus 4:22-25.
Balestrazzi A., Ventura L., Buttafava A., Donà M., Macovei A., Giovannini A., Nicoletti F., Langella R., Carbonera D. Mutation breeding in Petunia: ottimizzazione di parametri chiave, rigenerazione in vitro e screening di nuove varietà. 2° Convegno nazionale sulla micropropagazione. Sanremo, 7-9 novembre 2011. Acta Italus Hortus, in corso di stampa.
Donà M., Ventura L., Macovei A., Buttafava A., Confalonieri M., Savio M., Giovannini A., Carbonera D., Balestrazzi A. Gamma irradiation at low and high dose rates induces different survival responses in Petunia x hybrida cells Journal of Plant Physiology accepted.
Donà M., Ventura L., Buttafava A., Cicognini D., Giovannini A., Carbonera D., Nicoletti F., Dente F., Balestrazzi A. Effects of low-dose rate gamma irradiation on Petunia x hybrid explants in the context of mutation breeding. In preparazione.
La ricerca è stata inoltre divulgata in occasione di convegni internazionali e nazionali:
 28° International Horticultural Congress, Lisbona, Portogallo, 22-27 agosto 2010. Anca Macovei, Mattia Donà, Alma Balestrazzi, Federica Nicoletti, Annalisa Giovannini, Armando Buttafava, Raffaele Langella e Daniela Carbonera. Novel Markers for the antioxidant response in ornamental species.
9th LOWRAD Conference, Barcellona, Spagna, 2010. Donà M, Buttafava A, Balestrazzi A, Macovei A, Ventura L, Raimondi E, Belloni E, Bensi M, Savio M, Carbonera D, Giovannini A. Comparison of the biological effects of low dose gamma irradiation in plant and animal cell cultures.
 7th International Symposium on In Vitro Culture and Horticultural Breeding, Biotechnological advances in In Vitro Horticultural Breeding, Ghent, Belgio, 18-22 settembre 2011. Macovei A., Donà M., Balestrazzi A., Buttafava A., Raimondi E., Ventura L., Nicoletti F., Savio M., Maccario C., Carbonera D. Effects of dose and dose rate in gamma-irradiated Petunia hybrida cells: DNA damage and repair/antioxidant mechanisms.
 Structural Biology and DNA repair - A Current Opinion in Structural Biology Conference. Amsterdam, Netherlands, 16-18 ottobre 2011. Ventura L, Donà M, Macovei A, Buttafava A, Balestrazzi A, Giovannini A, Savio M, Carbonera D. 2011. Comet Assay: applications for the detection of DNA damage and repair in irradiated Petunia x hybrida plants
FLORMART, Salone Internazionale del Florovivaismo. Padova, 15-17 settembre 2011. Giovannini A., Nicoletti F., Dente F., Balestrazzi A., Donà M., Macovei A., Carbonera D., Ventura L., Buttafava A., Langhella R., Albani M. Mutagenesi fisica per il miglioramento genetico in varietà commerciali.
2° Convegno nazionale sulla micropropagazione. Sanremo, 7-9 novembre 2011. Balestrazzi A., Ventura L., Buttafava A., Donà M., Macovei A., Giovannini A., Nicoletti F., Langella R., Carbonera D. Mutation breeding in Petunia: ottimizzazione di parametri chiave, rigenerazione in vitro e screening di nuove varietà.

CONTATTI

Dr.ssa Giovannini Annalisa - CRA FSO Unità di ricerca per la Floricoltura e le Specie Ornamentali, Sanremo (IM)